液相色譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法聯(lián)用

劉廣軍
（濟(jì)寧師范專科學(xué)?；瘜W(xué)系,272025 ,山東省濟(jì)寧市）
　　摘要:用鄰苯二甲醛和N-乙酰-L 半胱氨酸作為柱前手性衍生化試劑,使用常規(guī)反相液相色譜法拆
分DL-氨基酸對(duì)映體,對(duì)于不能達(dá)到基線分離的色譜峰,應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算分析,從而達(dá)到同時(shí)定量測
定多種氨基酸對(duì)映體的目的.
關(guān)鍵詞:氨基酸;手性分離;液相色譜;衍生

　　近年來氨基酸分析在生物化學(xué)、藥學(xué)和臨床研究上都有著廣泛而重要的應(yīng)用. 氨基酸的分離,尤其
是氨基酸對(duì)映體的分離一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn).在手性分離這一領(lǐng)域,液相色譜法（HPLC） 一直
是zui廣泛使用的方法. 目前HPLC 分離手性化合物主要有兩種方法:一種是直接分離法,也就是利用手
性固定相直接分離手性化合物對(duì)映體. 王亞麗[1 ] 等曾用纖維素-三（ 3 , 5-二甲基苯基氨基甲酸酯）
（CDMPC） 手性柱在正相模式下拆分了3 種外消旋氨基酸的衍生物. 另一種是間接分離法,目前主要是
柱前衍生化法———將手性化合物柱前衍生化,將對(duì)映體轉(zhuǎn)化為非對(duì)映體,進(jìn)而使用常規(guī)柱完成分離分
析. 呂海濤[2 ] 曾討論過柱前衍生法拆分DL-氨基酸時(shí)流動(dòng)相的影響.
本文主要討論使用柱前衍生法分離多種氨基酸的對(duì)映體,并將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法引入絲氨酸對(duì)映體重疊峰的分析,可以一次性地定量分析多種氨基酸對(duì)映體. 所用衍生劑為鄰苯二甲醛（OPA） 和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） [2 ,3 ] . NAC 是一種手性硫醇,其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP） 、N-異丁酰-L-半胱氨酸（ IBLC） 、N-異丁酰-D-半胱氨酸（ IBDC） [4 ] 也可與OPA 一起做為衍生劑.
1 　實(shí)驗(yàn)部分
1. 1 　試劑與儀器
DL-絲氨酸（上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司） ;L-絲氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙
氨酸、L-苯丙氨酸、DL-纈氨酸、L-纈氨酸、硼酸、氯化鉀、*、乙酸鈉（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司） ;鄰苯二甲醛（以下簡稱OPA ,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司） ;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下簡稱
NAC ,Lancaster 公司） ;甲醇（HPLC 級(jí),Merck 公司） ;高純水. 除甲醇和水外其他試劑均為分析純.
美國Aglient HP1100 液相色譜儀（DAD 檢測器） ,ChemStation 化學(xué)工作站. 美國Aglient 8453 UV
- Vis 光譜儀.
1. 2 　樣品預(yù)處理[5 ]
各氨基酸樣品配制成濃度約為0. 01 M 的水溶液.硼酸緩沖液的配制:硼酸（0. 01 M） 、*
（0. 01 M） 和水按體積比50∶45∶5 配制得到pH 為9. 3的硼酸緩沖液.衍生劑的配制:將53. 3 mg OPA 溶于50 mL 甲醇得到OPA 甲醇溶液. NAC 溶于硼酸緩沖液中（0. 00286 M） . 取12 mL OPA 甲醇溶液、10 mL NAC 硼酸溶液,添加3 mL 硼酸緩沖液至25 mL ,得到OPAPNAC 衍生劑.
1. 3 　衍生反應(yīng)
將0. 1 mL 氨基酸與5 mL OPAPNAC 衍生劑*混合5 min 后過濾進(jìn)樣分析.
1. 4 　色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB - C8 色譜柱（4. 6 mm 3 150mm , 5μm） . 不同比例的甲醇和0. 05 M醋酸鈉水溶
液為流動(dòng)相,流速1 mL·min - 1 ,進(jìn)樣量20μL. 所有的色譜分離均在室溫下進(jìn)行, 在線檢測波長為334
nm ,DAD 檢測波長范圍為190～400 nm. 非負(fù)矩陣因子分解（NMF） 計(jì)算截取的數(shù)據(jù)波長范圍為320 nm～390 nm.
1. 5 　數(shù)據(jù)處理方法
本實(shí)驗(yàn)采用非負(fù)矩陣因子分解（NMF） [6 ] 計(jì)算兩個(gè)混合組分的純譜. 非負(fù)矩陣因子分解是在“非負(fù)”
限制約束條件下的一種矩陣分解新方法,它的基本思路是將非負(fù)矩陣V 分解成兩個(gè)非負(fù)因子矩陣W
和H.NMF 算法中采用了乘法更新公式（見公式（1）和（2） ） ,所以不必采用其它限制條件即能保證分解
結(jié)果“非負(fù)”.

2 　結(jié)果與討論
2. 1 　氨基酸對(duì)映體的分離
氨基酸與衍生劑的反應(yīng)生成異吲哚類產(chǎn)物[7 ] ,反應(yīng)方程式見圖1. 由紫外測量得到的圖譜可看出,
此類衍生產(chǎn)物在230 nm 和334 nm 處各有一個(gè)zui大吸收（見圖2） . 但由于230 nm 處較易受干擾,故在色
譜實(shí)驗(yàn)中除了記錄全波長數(shù)據(jù)外,選擇334 nm 作為檢測波長. 下文中所提到的氨基酸色譜峰均為其經(jīng)
過上述衍生化后所得到的衍生物的色譜峰.

圖1 　DL-丙氨酸的衍生反應(yīng)方程式
圖2 　2β丙氨酸衍生物在190 nm～400 nm 處紫外吸收
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70 的淋洗條件下,除DL-絲氨酸的兩種對(duì)映體有部分重
疊外,DL-丙氨酸、DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸的對(duì)映體能得到基線分離,但是DL-纈氨酸的兩種對(duì)映體
出峰時(shí)間為17 min 和25 min ,DL-苯丙氨酸的兩種對(duì)映體出峰時(shí)間為38 min 和43 min. 此分離條件下,不僅浪費(fèi)流動(dòng)相,而且峰形不理想. 如果將流動(dòng)相的比例調(diào)節(jié)至45∶55 ,雖然可使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨
酸的對(duì)映體在10 min 內(nèi)洗脫出峰,但將使DL-絲氨酸及DL-丙氨酸*或部分重疊.
考慮到DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸保留過強(qiáng)的情況,操作中采用了簡單的梯度淋洗,在前三種氨基
酸全部出峰后,改變流動(dòng)相配比使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰. 淋洗方案如下:在0～6 min 內(nèi)
保持甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70 不變,在6～7 min 由此比例線性變化至45∶55 ,在7 min 以后保持45∶55
不變. 各對(duì)對(duì)映體的定性采用左旋光學(xué)純標(biāo)樣通過內(nèi)標(biāo)法確定.β丙氨酸沒有手性,沒有對(duì)映異構(gòu)體,
只有一個(gè)色譜峰. 圖3 為DL-絲氨酸、DL-丙氨酸、β丙氨酸、DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸混合物衍生后的
色譜圖.

圖3 　四種外消旋氨基酸和β丙氨酸的色譜
2. 2 　波譜解析法的使用
由圖3 可看出,盡管采用梯度洗脫,此譜中仍有一對(duì)重疊峰—絲氨酸的兩個(gè)對(duì)映體. 在這種情況下,

如果要定量分析此體系,知道兩組分的實(shí)際峰面積是必需的. 我們使用非負(fù)矩陣因子分析解析出兩組
分的純譜（見圖4） ,但此結(jié)果與實(shí)際純譜還存在一個(gè)系數(shù)關(guān)系,即AXD-Ser + BXL-Ser = YDL-Ser . 為得到兩組分實(shí)際的純譜,我們用zui小二乘回歸（ least squaresregress , LSR） 來計(jì)算系數(shù)A 和B ,得到的結(jié)果如下（見圖5） : A = 72. 59 ; B = 75. 98. 此系數(shù)乘以各自組分的純譜即為兩組分的實(shí)際峰面積.

2. 3 　各對(duì)映體的定量分析
2. 3. 1 　標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立　采用單一對(duì)映體標(biāo)樣在不同濃度值下的色譜峰面積或峰高建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.
實(shí)驗(yàn)中選用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作為兩種標(biāo)樣,L-丙氨酸對(duì)應(yīng)甲醇∶醋酸鈉= 30∶70 的色譜條件,L-
苯丙氨酸對(duì)應(yīng)甲醇∶醋酸鈉= 45∶55 的色譜條件. 以濃度對(duì)峰面積或峰高進(jìn)行線性擬和,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線
方程（見圖6 ,7） . 通過此方程可以測定混合樣品中兩個(gè)標(biāo)樣組分的濃度.
2. 3. 2 　其它組分相對(duì)濃度預(yù)報(bào)　在同樣的色譜條件下,體系中各組分的含量比與其色譜峰面積比成
線性關(guān)系. 各組分的峰面積和所占面積面分比結(jié)果見表1 ,其中D-絲氨酸和L-絲氨酸的單峰面積是根據(jù)上述化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算而得.

3 　結(jié)　論
本文運(yùn)用柱前衍生化法使用常規(guī)反相液相色譜實(shí)現(xiàn)了4 種氨基酸對(duì)映體的拆分,達(dá)到了較好
的分離效果,并實(shí)現(xiàn)了多組分定量分析. 文中所用的淋洗方案也比較簡單. 使用計(jì)算方法解析重疊峰相
對(duì)降低了對(duì)色譜峰分離度的要求,這對(duì)于分析更加復(fù)雜的樣品體系是很有幫助的